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发信人: special (xxxx), 信区: Biology
标 题: 请教关于western blotting的问题
发信站: The unknown SPACE (Thu May 23 02:34:33 2002) WWW-POST
电泳时蛋白上样量为50ug/ml,一级抗体为10ul:1mlTBS，二级抗体2ul:1mlTBS,结果带没有
显示出来。随后改为一级抗体为15ul:1mlTBS，二级抗体15ul:1mlTBS,带清晰可见。我想
问一下，平时大家做western blotting时，1，2级抗体都是用多少倍比？抗体的倍比同蛋
白上样量的关系如何？
--
※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 133.5.48.89]
发信人: Ras (很颓的猪。), 信区: Biology
标 题: Re: 请教关于western blotting的问题
发信站: The unknown SPACE (Thu May 23 11:21:40 2002), 转信
第一种配比的情况你重复过几次？
如果只是一次的话，我很怀疑是你实验过程中的其它error导致没有detectable band的。
一二及抗体的比完全取决于抗体的sensitivity, 不能一概而轮。
偶用AP system的时候一及1:100-1000, 二及1:7500.
ECL system的时候一及1:100-1000, 二及1:2000-5000.
【 在 special (xxxx) 的大作中提到: 】
: 电泳时蛋白上样量为50ug/ml,一级抗体为10ul:1mlTBS，二级抗体2ul:1mlTBS,结果带没有
: 显示出来。随后改为一级抗体为15ul:1mlTBS，二级抗体15ul:1mlTBS,带清晰可见。我想
: 问一下，平时大家做western blotting时，1，2级抗体都是用多少倍比？抗体的倍比同蛋
: 白上样量的关系如何？
--
一年老一年，一日没一日，
一秋又一秋，一辈催一辈，
一聚一离别，一喜一伤悲。
一榻一身卧，一生一梦里。
寻一夥相识，他一会咱一会，都一般相知，
吹一回，唱一回。
※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 152.3.117.238]
发信人: scoop (大铲), 信区: Biology
标 题: Re: 请教关于western blotting的问题
发信站: The unknown SPACE (Thu May 23 12:30:56 2002) WWW-POST
如果是买的一抗，我一般按product sheet的说明做，大多是1:1000到1:5000, 少数也可能是1:200; 如果是自己做的抗体，还是应该做不同比例试试。二抗我一律用１:10000.
我用的也是ECL.
【 在 Ras (很颓的猪。) 的大作中提到: 】
: 第一种配比的情况你重复过几次？
: 如果只是一次的话，我很怀疑是你实验过程中的其它error导致没有detectable band的。
:
: 一二及抗体的比完全取决于抗体的sensitivity, 不能一概而轮。
: 偶用AP system的时候一及1:100-1000, 二及1:7500.
: ECL system的时候一及1:100-1000, 二及1:2000-5000.
:
:
: 【 在 special (xxxx) 的大作中提到: 】
: : 电泳时蛋白上样量为50ug/ml,一级抗体为10ul:1mlTBS，二级抗体2ul:1mlTBS,结果带没有
: : 显示出来。随后改为一级抗体为15ul:1mlTBS，二级抗体15ul:1mlTBS,带清晰可见。我想
: : 问一下，平时大家做western blotting时，1，2级抗体都是用多少倍比？抗体的倍比同蛋
: : 白上样量的关系如何？
:
:
--
※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 129.112.109.253]
发信人: lex (桃花仙), 信区: Biology
标 题: Re: 请教关于western blotting的问题
发信站: The unknown SPACE (Thu May 23 16:04:59 2002) WWW-POST
why don't you do titration with different ratios?
【 在 special (xxxx) 的大作中提到: 】
: 电泳时蛋白上样量为50ug/ml,一级抗体为10ul:1mlTBS，二级抗体2ul:1mlTBS,结果带没
有
: 显示出来。随后改为一级抗体为15ul:1mlTBS，二级抗体15ul:1mlTBS,带清晰可见。我
想
: 问一下，平时大家做western blotting时，1，2级抗体都是用多少倍比？抗体的倍比同
蛋
: 白上样量的关系如何？
:
:
--
※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 141.214.14.6]
发信人: forrestgump (sleepless in Houston), 信区: Biology
标 题: Re: 请教关于western blotting的问题
发信站: The unknown SPACE (Thu May 23 21:09:27 2002) WWW-POST
Western blot can detect proteins at ~ ng level, depending on the Ab
sensitivity. good Abs can even detect 0.1 ng protein or below.
dilution ratio for primary Ab is usually around 1:100 -- 1:2000, secondary is
1:2000 -- 1:10000.
what do you mean by 50 ug/ml loading? how much protein did you load (in terms
of ng) in that lane?
【 在 special (xxxx) 的大作中提到: 】
: 电泳时蛋白上样量为50ug/ml,一级抗体为10ul:1mlTBS，二级抗体2ul:1mlTBS,结果带没
有
: 显示出来。随后改为一级抗体为15ul:1mlTBS，二级抗体15ul:1mlTBS,带清晰可见。我
想
: 问一下，平时大家做western blotting时，1，2级抗体都是用多少倍比？抗体的倍比同
蛋
: 白上样量的关系如何？
:
:
--
LIfe is like a box of chocolate.
You never know what is going to be the next.
※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 128.249.148.122]
发信人: special (xxxx), 信区: Biology
标 题: Re: 请教关于western blotting的问题
发信站: The unknown SPACE (Thu May 23 23:29:52 2002) WWW-POST
sample的浓度全部为50ug/ml。老板要求western blotting时，sample的上样量必须一致
，我总共11个sample,每个sample的上样量全部为50ug/ml。不知各位是否也是这样做的？
【 在 forrestgump (sleepless in Houston) 的大作中提到: 】
: Western blot can detect proteins at ~ ng level, depending on the Ab
: sensitivity. good Abs can even detect 0.1 ng protein or below.
: dilution ratio for primary Ab is usually around 1:100 -- 1:2000, secondary
is
: 1:2000 -- 1:10000.
: what do you mean by 50 ug/ml loading? how much protein did you load (in
terms
: of ng) in that lane?
:
: 【 在 special (xxxx) 的大作中提到: 】
: : 电泳时蛋白上样量为50ug/ml,一级抗体为10ul:1mlTBS，二级抗体2ul:1mlTBS,结果带
没
: 有
: : 显示出来。随后改为一级抗体为15ul:1mlTBS，二级抗体15ul:1mlTBS,带清晰可见。
我
: 想
: : 问一下，平时大家做western blotting时，1，2级抗体都是用多少倍比？抗体的倍比
同
: 蛋
: : 白上样量的关系如何？
: :
: :
:
--
※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 133.5.48.89]
发信人: forrestgump (sleepless in Houston), 信区: Biology
标 题: Re: 请教关于western blotting的问题
发信站: The unknown SPACE (Fri May 24 12:39:12 2002) WWW-POST
right. of course you have to keep them consistent.
but, concentration is concentration, and amount is amount. I just wanted to
know how much protein (not concentration but amount) you loaded for each lane
and how much your protein of interest is there (estimation) to see if it is
within the usual detection limit.
anyway, it is very unlikely that a change from 10 ul to 15 ul can make such a
big difference. how long did you expose it to X-ray film?
【 在 special (xxxx) 的大作中提到: 】
: sample的浓度全部为50ug/ml。老板要求western blotting时，sample的上样量必须一
致
: ，我总共11个sample,每个sample的上样量全部为50ug/ml。不知各位是否也是这样做的
？
: 【 在 forrestgump (sleepless in Houston) 的大作中提到: 】
: : Western blot can detect proteins at ~ ng level, depending on the Ab
: : sensitivity. good Abs can even detect 0.1 ng protein or below.
: : dilution ratio for primary Ab is usually around 1:100 -- 1:2000, secondary
: is
: : 1:2000 -- 1:10000.
: : what do you mean by 50 ug/ml loading? how much protein did you load (in
: terms
: : of ng) in that lane?
: :
: : 【 在 special (xxxx) 的大作中提到: 】
: : : 电泳时蛋白上样量为50ug/ml,一级抗体为10ul:1mlTBS，二级抗体2ul:1mlTBS,结果
带
: 没
: : 有
: : : 显示出来。随后改为一级抗体为15ul:1mlTBS，二级抗体15ul:1mlTBS,带清晰可见
。
: 我
: : 想
: : : 问一下，平时大家做western blotting时，1，2级抗体都是用多少倍比？抗体的倍
比
: 同
: : 蛋
: : : 白上样量的关系如何？
: : :
: : :
: :
:
:
--
LIfe is like a box of chocolate.
You never know what is going to be the next.
※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 128.249.148.55]
发信人: citieeg (好吃的虾), 信区: Biology
标 题: Re: 请教关于western blotting的问题
发信站: The unknown SPACE (Fri May 24 12:39:35 2002), 站内信件
en, it also depends on poly or mono antibody u r using.
【 在 Ras (很颓的猪。) 的大作中提到: 】
: 第一种配比的情况你重复过几次？
: 如果只是一次的话，我很怀疑是你实验过程中的其它error导致没有detectable band的。
: 一二及抗体的比完全取决于抗体的sensitivity, 不能一概而轮。
: 偶用AP system的时候一及1:100-1000, 二及1:7500.
: ECL system的时候一及1:100-1000, 二及1:2000-5000.
: 【 在 special (xxxx) 的大作中提到: 】
: : 电泳时蛋白上样量为50ug/ml,一级抗体为10ul:1mlTBS，二级抗体2ul:1mlTBS,结果带没有
: : 显示出来。随后改为一级抗体为15ul:1mlTBS，二级抗体15ul:1mlTBS,带清晰可见。我想
: : 问一下，平时大家做western blotting时，1，2级抗体都是用多少倍比？抗体的倍比同蛋
: : 白上样量的关系如何？
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我至少将得到虚无。
微风起来，四面都是灰土。另外有几个人各自走路。
※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 129.105.168.123]
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